微量DNA 提取方法

作者:新景实验室
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 1、快速微量提取法

1. 1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min 丢去上清夜,收集菌体。

2. 加入400μl裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA1%SDSpH7.8)混匀,置于37水浴1h

3. 然后加入200 μl  5 mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min

4. 取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。

5. 2倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M pH8.0)-20保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于50μlTE溶液中,置4保存备用。

 

2、加热去蛋白法提取基因组DNA

试剂:

裂解液:10.95g蔗糖5ml 0.1 mmol/L MgCl22ml 0.5mmol/LTris·HCl (pH7.5),1ml TritonX-100,加灭菌双蒸水至,100ml;提取液:10ml 0.5 mmol/L KCl 2.5ml 0.1mol/L MgCl22ml 0.5mmol/LTris·HCl(pH8.3),0.45ml NP-40,0.45mlTween-20,加灭菌双蒸水至100ml;蛋白酶K20mg/ml(贮存液);TE缓冲液(pH8.0),0.2ml 0.5mmol/L EDTA pH8.0),加水至100ml

基因组DNA的提取

抗凝全血0.5ml加等量的裂解液,颠倒混匀后,4放置30min,离心3000rpm10min,弃上清;用0.2ml提取液悬浮沉淀,加入10μl蛋白酶K20mg/ml),颠倒混匀后,55水浴60min,沸水浴中保温10min;离心12000rpm20min 后,小心吸取上清上清中加入2.5倍体积的冷无水乙醇,颠倒混匀后,-20静置30min,离心12000rpm20min,弃去水相;沉淀用75%冷乙醇洗涤2次,同上离心,10min,弃去上清;在超净工作台中空气干燥10min,溶于20μl缓冲液中-20保存。

 

3、碘化钠法(参照Loparev等法加以改良)提取基因组DNA

试剂

6mmol/L碘化钠溶液:1.5g Na2SO3溶于80灭菌水中,加入90g NaI,溶解后定容至100ml;氯仿;异丙醇;TE缓冲液(pH8.0

基因组DNA的提取

抗凝全血0.5ml加等量的无菌水0.5ml颠倒混匀;加6mmol/L NaI 1ml,涡旋震荡30s;加等体积氯仿/异丙醇(24:1)混匀;412000rpm 离心10min,小心吸取上清;加0.6倍体积异丙醇混匀;室温(或4)静置15min412000rpm离心,10min,弃去上清;沉淀用37%异丙醇洗1次,在超净工作台干燥,溶于20μl TE缓冲液中,-20保存。

 

4TTTritonX-100Tris-HCl等混合液的总称)溶血法提取基因组DNA

试剂

裂解液:10.95g蔗糖5ml 0.1 mmol/L MgCl22ml0.5mmol/L Tris·HCl(pH7.5),1ml TritonX-100,加水至,100ml;提取液:10ml 0.5 mmol/L KCl 2.5ml0.1mol/L MgCl22ml 0.5mmol/LTris·HCl(pH8.3),0.45mlNP-40,0.45ml Tween-20 ,加水至100ml;蛋白酶K 20mg/ml(贮存液);Tris平衡液;氯仿;TE缓冲液(pH8.0)。

基因组DNA的提取

抗凝全血0.5ml加等量的裂解液,颠倒混匀后,4放置30min;离心3000rpm10min,弃上清;用0.2ml提取液,10μl蛋白酶K储存液悬浮沉淀,颠倒混匀后,55水浴66min;加等体积Tris平衡酚/氯仿(11)颠倒混匀后,离心12000rpm10min;小心吸取上清,加入2.5倍体积的冷无水乙醇,颠倒混匀后,-20静置30min;离心12000rpm10min,弃去水相;沉淀用75%冷乙醇洗涤两次,同上离心10min弃去上清;在超净工作台中空气干燥10min,溶于20μl缓冲液中,-20保存。

 

5、氯化胺法提取基因组DNA

试剂

10×红细胞裂解液:8.29h NH4Cl1.0g KHCO30.037g EDTA,加水至100ml;白细胞裂解液:0.5ml 2mmol/L TrispH8.2),10ml 4mmol/L NaCl0.4ml 0.5mmol/L EDTA,加水至100ml10%W/VSDS;蛋白酶K20mg/ml(贮存液)Tris平衡酚;氯仿;TE缓冲液(pH8.0

基因组DNA的提取

抗凝全血0.5ml2倍的1×红细胞裂解液,颠倒混匀后,冰上静置30min直至溶液变透明;离心3000rpm10min弃上清;加300μl白细胞裂解液,颠倒混匀,加30μl 10%W/V),的SDS颠倒混匀;直到出现粘稠透明状为止;加10μl蛋白酶K储存液,颠倒混匀后,55水浴60min,加等体积Tris平衡酚/氯仿(11)颠倒混匀后,离心12000rpm10min;小心吸取上清,加入2.5倍体积的冷无水乙醇,颠倒混匀后,-20静置30min;离心12000rpm10min,弃去水相;沉淀用75%冷乙醇洗涤两次,同上离心10min,弃去上清;在超净工作台中空气干燥10min,溶于20μl TE缓冲液中,-20保存。