实测植物总RNA提取液套装提取土豆、桑叶中的RNA

作者:新景实验室
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一直以来,搞植物研究的同学们对Trizol试剂提取植物RNA诟病不断,在这样的背景和需求下,我们特别研发了植物总RNA提取液套装,套装中除了植物总RNA提取液外,还包括了Buffer EX(氯仿替代品)RNA沉淀液(异丙醇替代品)以及β-巯基乙醇。真可谓一个套装在手,提取植物RNA无烦恼!现在我们特别选择了土豆块茎Trizol试剂提取失败)和桑叶(Trizol试剂提取效率极低)两个典型样本实测植物总RNA提取套装的效果。

实验目的:

用植物总RNA提取液套装从桑叶和土豆块茎中提取RNA

实验材料:

桑树叶片、土豆块茎,研钵,植物总RNA提取液套装(Simgen Cat. No.5123100

超微量电子天平(DENVER INSTRUMENTTP-213

旋涡震荡器(越新仪器,XH-C

台式离心机(eppendorf Centrifuge 5415 D

超微量分光光度计(Simgen Cat.No.sim100

电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6C型 )

土豆内参引物(FATTGGAAACGGATATGCTCCA/RTCCTTACCTGAACGCCTGTCA

2×One Step SYBR Green RT-qPCR MixSimgen Cat. No.7405500

荧光定量PCR仪(ABI7500

实验内容:

1. 在研钵中加入约300 mg小块的土豆块茎或桑树叶片,加入1.8 ml已加入β-巯基乙醇的植物总RNA提取液,然后用研磨棒进行研磨,直至组织呈匀浆状

2. 吸取700 μl混合液分装到两个1.5 ml离心管中(备注:在植物总RNA提取液套装说明书中步骤12要求将植物样本经液氮磨成粉末状后再按每管100 mg的量分装到1.5 ml离心管中,每管再加入600 μlβ-巯基乙醇的植物总RNA提取液)。

3. 加入600 μl Buffer EX,用力混合均匀,13000 rpm离心10分钟。

4. 小心吸取350 μl上清,转入一个洁净的1.5 ml离心管中。

5. 在上清液中加入等体积的RNA沉淀液,盖上管盖混合均匀,13000 rpm离心5分钟

6. 弃上清,低速离心数秒使管壁上的上清液聚集到管底,用200 μl吸头吸尽残留的上清液。

7. 加入1 ml 70%乙醇,盖上管盖,旋涡震荡悬浮RNA沉淀13000 rpm离心3分钟

8. 弃上清,盖上管盖,低速离心数秒使管壁上的乙醇沉降到管底,用200 μl吸头吸尽残留的乙醇,保留管底及管壁的白色RNA沉淀。室温静置5分钟干燥RNA

9. 根据RNA沉淀量加入适量RNase-free水(土豆块茎样本50 μl,桑叶样本200 μl)旋涡震荡溶解RNA,在微量分光光度计上测量RNA的浓度,然后进行琼脂糖凝胶电泳。

10. 按照2×One Step SYBR Green RT-qPCR Mix的说明书操作,对提取到的土豆RNA进行荧光PCR扩增。

实验结果:

1. 在微量分光光度计上用RNase-Free Water调零,测量提取好的RNA,结果如下:


12是土豆使用植物总RNA提取液套装所获得的总RNA34是桑叶使用植物总RNA提取液套装所获得的总RNA

2. 1%的琼脂糖凝胶上,加入5 μl提取到的RNA,电泳20 min,结果如下:

1、2条带是土豆RNA电泳结果;34条带是桑叶RNA电泳结果M是DL2000 Marker

3、土豆RNA荧光PCR曲线图


实验讨论与分析:

1. 从微量分光光度计测的结果上分析,使用Simgen植物总RNA提取液套装,不论是土豆块茎还是桑叶都获取到了纯度非常高的RNA。通常Trizol试剂提取的RNA会出现的A260/A230值偏低的情况没有出现。

2. 从电泳图上分析,RNA条带完整,有不明显的基因组DNA污染(土豆RNA)或者根本就观察不到基因组DNA污染(桑叶RNA与分光光度计测得的数据有较好的对应关系。

3. 从荧光PCR结果上分析,扩增曲线正常,无抑制现象。

综上所述,植物RNA提取液套装是与Trizol试剂完全不同的产品,不仅不涉及酚氯仿的使用,而且非常适合从高多糖多酚的植物样本中提取RNA。除此之外,植物RNA提取液套装不仅操作步骤Trizol试剂更为简单方便,同时又与Trizol试剂一样,对样本的用量没有限制,非常适合一次需要提取非常大量RNA的用户使用。

 

                                                      Simgen实验室

2020.08.28