全血DNA提取方法

作者:新景实验室
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方法一:

1.将冰冻的血在室温下溶化;
2.
1ml血液转入一无菌的2ml离心管中,加入等体积的PBS磷酸盐缓冲液,充分混匀后12000rpm离心5min,弃上清;
3.
加入667μl STE24μl20%SDS37水浴1h
4.
10μl20mg/ml的蛋白酶K混匀,55水浴消化过夜(1014h);
5.
将消化的样品加入等体积的Tris饱和酚,充分摇匀,12000rpm离心10min
6.
将上层水相转入另一无菌2ml离心管中;再加入等体积的Tris饱和酚,充分摇匀,12000rpm离心10min
7.
将上层水相转入另一无菌2ml离心管中;并加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25241),旋涡振荡至充分混匀,12000rpm离心10min
8.
将上层水相转入另一无菌2ml离心管中;并加入等体积的氯仿∶异戊醇(241),充分振荡混匀,12000rpm离心10min
9.
将上清液转移到另一无菌2ml离心管中;加入2倍体积的冰乙醇,1/10体积醋酸钠水平摇动,直到可见絮状DNA析出;
10.
将样品置-20冰箱冷冻30min或冰浴1520min,取出后再次12000rpm离心10min,使DNA沉淀;
11.
用枪头将DNA挑到另一无菌离心管中,用适量的70%乙醇洗涤并晃动,以洗出DNA的杂质;
12.
 倒出乙醇,将DNA用真空干燥或自然晾干,加入适量的TE缓冲液回溶,-20保存备用。

 

方法二:

蛋白酶K

取抗凝血样500μL,加入等体积的蒸馏水溶解红细胞,于12000 r/min离心15 min,弃上清。在上管中加500μL 蒸馏水,12000 r/min离心15m in,弃上清.在沉淀中加入500μL裂解液1 mo l/LTris-HCl pH 7. 50. 5 mo l/L EDTA pH7. 50. 5 %SDS1μL RNase2μL蛋白酶K55消化过夜。用500μL-氯仿-异戊醇(25241) 抽提,10000 r/min离心10min,将上清转移入另一洁净的管子,重复上述操作1次。加2倍体积无水乙醇颠倒混匀数次至DNA絮状析出,用75 %的乙醇沉淀DNA抽干,50μL TE溶解DNA4保存备用。

 

方法三:

氯仿-异戊醇法

取抗凝血500μL 置于1.5 mL Eppendorf管中,加细胞裂解缓冲液1mL (0.32 mo l/L 蔗糖; 1% Triton X-1000.005 mmol/L MgCl2·6H2O0.012 mo l/LTris-HCl pH7. 5),混合,12000 r/m in离心5min,弃上清。重复上述裂解1次。于沉淀物中加入500μL灭菌蒸溜水溶解红细胞,12000 r/m in离心10 min弃上清,用80μL DNA稀释缓冲液(0.375mo l/L N aCl0.12 mo l/L EDTA ) 将沉淀轻轻重悬,加入15μL 20 % SDS100μL 5 mo l/LN aCl,充分混匀30s,再加入240μL无菌双蒸水、350μL 氯仿-异戊醇(241 体积) 混合液充分混匀30s12000 r/min 离心3min。将上清转至另支Eppendorf 管中,加860 LL 无水乙醇颠倒混匀数次至DNA 絮状析出,12 000 r/m in 离心3 min,弃上清,37干燥. 50μL TE 溶解DNA,备用。

 

方法四:

碘化钾法

350μL 抗凝全血中加无菌双蒸水900μL 溶解,10000 r/min 离心5m in 弃上清,重复上述试验1次,将沉淀物混匀。加70μL 5 mol/L KI,旋涡振荡30s,加0. 9 % NaCl 300μL,氯仿-异戊醇(241) 450μL,充分振荡1min12 000 r/m in 离心5m in,吸取水相层于另支Eppendorf 管中,加异丙醇180μL,充分混匀,12000 r/m in 离心5 m in 弃净上清,加无水乙醇1mL12000 r/min 离心5min,弃净乙醇,待干,以50μL TE 溶解DNA备用.